Длительный срок службы, высокая стабильность, высокая чувствительность Микросферы с эрибием для временного разрешения флуоресценции способствуют быстрому количественному определению АЛП 

В рамках исследований, посвящённых применению микросфер с временным разрешением флуоресценции и диагностике на месте (POCT), была разработана полная технологическая схема: «получение микросфер из карбоксильного полистирола — инкапсуляция Eu(TTA)₃phen — конъюгация с антителами — иммунохроматографический анализ». Полученные микросферы с временным разрешением флуоресценции имели средний размер частиц около 207 нм, демонстрировали характерное излучение Eu³⁺ при 614 нм и имели время жизни флуоресценции 0,640 мс; при дальнейшем использовании в иммунохроматографическом анализе на АФП тестирование можно было завершить за 15 минут, а предел обнаружения достигал 0,4 нг/мл.

Основные показатели производительности

I. Монодисперсные микросферы с карбоксильными группами: стабильный носитель для нанесения флуоресцентных маркеров и конъюгации с антителами
Однородность размеров микросфер, стабильность дисперсии и поверхностные функциональные группы являются ключевыми факторами, определяющими последующее нанесение флуоресцентных маркеров, конъюгацию с антителами и повторяемость результатов анализа. В ходе исследования сначала были получены микросферы из полистирола с карбоксильными группами на поверхности методом эмульсионного полимеризации. Путем систематической оптимизации таких параметров, как дисперсионная среда, эмульгатор, инициатор, количество мономера, температура реакции, время реакции и количество функционального мономера, в конечном итоге были получены карбоксильные полистирольные микросферы со средним размером частиц около 182 нм.
Результаты сканирующей электронной микроскопии и измерения размера частиц показали, что поверхность микросфер гладкая, морфология регулярная, а размер частиц в основном сосредоточен в диапазоне 170–210 нм, что свидетельствует о хорошей монодисперсности. Введение акрилового функционального мономера позволяет сохранить на поверхности микросфер реакционные сайты в виде карбоксильных групп, которые в дальнейшем могут образовывать стабильные амидные связи с аминогруппами на поверхности белков посредством системы EDC/NHS, создавая материальную основу для последующего создания иммунных зондов.

Рис. 1. Морфология микросфер карбоксил-полистирола по данным СЭМ и распределение их размеров (оригинальный рисунок из статьи)

II. Включение комплексов европия: создание микросфер с временным разрешением, обладающих «внутренним свечением и возможностью поверхностного соединения»
На основе стабильного карбоксильного полистирольного носителя в качестве светящегося центра был выбран Eu(TTA)₃phen, а для встраивания комплекса европия внутрь микросфер был использован метод разбухания. После оптимизации таких параметров, как тип разбухающего агента, температура разбухания, время разбухания и количество комплекса, в конечном итоге были получены флуоресцентные микросферы с европием для временного разрешения, имеющие средний диаметр около 207 нм и хорошую дисперсию.
Такая конструкция обладает явными преимуществами: с одной стороны, внутри микросферы можно аккумулировать несколько редкоземельных люминесцентных центров, что позволяет усилить сигнал отдельной частицы; с другой стороны, люминесцентный материал, встроенный в полимер, не занимает поверхностных карбоксильных групп, благодаря чему внешний слой микросферы по-прежнему может использоваться для ковалентного связывания биомолекул, таких как антитела, что обеспечивает функциональное разделение: «внутренняя часть отвечает за свечение, а поверхность — за распознавание».

Рис. 2. Морфология микросфер с эрибием, демонстрирующих флуоресценцию с временным разрешением, по данным СЭМ (оригинальное изображение из статьи)

III. Характерное излучение при 614 нм и время жизни порядка миллисекунд: повышение устойчивости к фоновому излучению при временном разрешении
Флуоресцентный спектр показывает, что при возбуждении с длиной волны 343 нм микросферы с временным разрешением демонстрируют типичное характерное излучение Eu³⁺ в видимом диапазоне: пики излучения наблюдаются при длинах волн около 579, 592, 614, 650 и 700 нм, причем пик перехода ⁵D₀→⁷F₂ при 614 нм является самым сильным и проявляется в виде яркого красного флуоресцентного сигнала.

Рис. 3. Спектр флуоресцентного излучения микросфер с временным разрешением в оптимальных условиях (оригинальный рисунок из статьи)

Дальнейшие измерения времени жизни флуоресценции показали, что среднее время жизни флуоресценции свободного Eu(TTA)₃phen составляет около 0,870 мс, а после инкапсуляции в полистирольные микросферы среднее время жизни флуоресценции по-прежнему достигает 0,640 мс. Несмотря на некоторое сокращение времени жизни после инкапсуляции, сохраняется явная характеристика длительного свечения в диапазоне миллисекунд. По сравнению со спонтанной флуоресценцией в биологических образцах, которая обычно имеет длительность порядка наносекунд, эта разница в длительности создает основу для отложенной регистрации сигналов и снижения помех от короткоживущего фонового сигнала.

Рис. 4. Кривые затухания флуоресценции Eu(TTA)₃phen и флуоресцентных микросфер с эврием, полученных методом временного разрешения (оригинальный рисунок из статьи)

IV. Преимущества в плане стабильности: широкий диапазон pH, хорошая стабильность при хранении и устойчивость к световому отбеливанию
Для реальных диагностических реагентов требуется не только высокая начальная интенсивность флуоресценции, но и стабильность сигнала при различных буферных условиях, в течение всего срока хранения и при непрерывном возбуждении. Тестирование pH-стабильности показало, что в диапазоне pH 4–10 размер микросфер, PDI и относительная интенсивность флуоресценции при 614 нм в целом остаются стабильными; в более экстремальных кислотных или щелочных условиях размер частиц и PDI претерпевают определенные изменения, а интенсивность флуоресценции несколько снижается.

Рис. 5. Изменение размера частиц, PDI и интенсивности флуоресценции флуоресцентных микросфер при различных значениях pH (оригинальный рисунок из статьи)

В ходе эксперимента по хранению при 4 °C в защищённом от света месте диаметр микросфер в период от 0 до 40 дней в целом оставался на уровне около 200 нм, а PDI сохранялся на низком уровне; после 40 дней хранения относительная интенсивность флуоресценции при 614 нм по-прежнему составляла более 85 % от исходного значения, что свидетельствует о хорошей стабильности при хранении.

Рис. 6. Изменение размера частиц, PDI и интенсивности флуоресценции флуоресцентных микросфер в зависимости от времени хранения (оригинальный рисунок из статьи)

При непрерывном возбуждении с длиной волны 343 нм в течение 60 минут интенсивность флуоресценции микросфер с временным разрешением снизилась с начальных 100 % до примерно 96 %, причем степень затухания была небольшой; интенсивность флуоресценции свободного Eu(TTA)₃phen снизилась до примерно 89 %. Результаты показывают, что полистирольная оболочка обеспечивает более стабильную микросреду для светоизлучающих центров, что повышает устойчивость к фотоотбеливанию.

Рис. 7. Сравнение светостойкости флуоресцентных микросфер с временным разрешением и Eu(TTA)₃phen (оригинальный рисунок из статьи)

V. Биологическая функционализация: после оптимизации эффективность конъюгации белков достигла 58,51 %
С целью применения микросфер с временным разрешением флуоресценции в иммунологических анализах в ходе исследования была создана система ковалентной конъюгации EDC/NHS с использованием карбоксильных групп на поверхности микросфер; при этом в качестве модельного белка использовался BSA для изучения таких факторов, как способ активации, буферная система, pH и концентрация EDC/NHS. При использовании только EDC для активации эффективность конъюгации с белком составила 25,73%; после совместной активации с помощью EDC/NHS эффективность конъюгации повысилась до 38,43%.
После дальнейшей оптимизации буферной системы и условий реакции при концентрации EDC/NHS 1,00 мг/мл эффективность связывания микросфер с белком достигла 58,51 %, что является максимальным значением среди исследованных условий. Этот результат свидетельствует о том, что встраивание комплексов европия не нарушает способность поверхности микросфер к биологическому связыванию, и материал позволяет одновременно обеспечить стабильное свечение и фиксацию молекул для иммунологического распознавания.
VI. Применение в POCT: экспресс-количественный анализ AFP за 15 минут
На основе проверки характеристик материала в ходе исследования было осуществлено ковалентное соединение микросфер с эрибием, обладающих временной разрешающей способностью, с моноклональными антителами к AFP для создания иммунофлуоресцентной зонды с временной разрешающей способностью, а также сборка иммунохроматографических тест-полосок для AFP по принципу «сэндвич» с использованием двух антител. Образец мигрирует под действием капиллярной силы; при наличии антигена AFP он образует «сэндвич»-комплекс с антителом, меченным флуоресцентными микросферами, и захватывающим антителом на линии T, накапливается на тестовой линии и генерирует сигнал временной флуоресценции.

Рис. 8. Структура и принцип работы тест-полоски для флуоресцентной иммунохроматографии с временным разрешением (оригинальный рисунок из статьи)

Анализ оптимизации времени иммунной реакции показал, что при концентрациях АФП 0,5, 2, 5 и 20 нг/мл сигнал HT/HC постепенно возрастал по мере увеличения времени реакции и стабилизировался примерно через 15 минут. С учетом полноты реакции и эффективности анализа в качестве рекомендуемого времени проведения анализа было окончательно определено 15 минут.

Рис. 9. Изменение соотношения HT/HC в зависимости от времени иммунного ответа при различных концентрациях АФП (оригинальный рисунок из статьи)

VII. Количественные характеристики: диапазон определения 0,5–40 нг/мл, предел обнаружения 0,4 нг/мл.
Количественная зависимость была установлена с использованием стандартных растворов АФП концентрацией 0, 0,5, 2, 5, 10, 20 и 40 нг/мл; с увеличением концентрации АФП соотношение HT/HC одновременно увеличивалось. Уравнение аппроксимации квадратичной функцией имеет вид y = -0,00132x² + 0,1725x + 0,0476, коэффициент корреляции R² = 0,9997, что свидетельствует о хорошей количественной корреляции между сигналом анализа и концентрацией АФП в исследуемом диапазоне.

Рис. 10 Эталонная кривая зависимости концентрации AFP от соотношения HT/HC (оригинальный рисунок из статьи)

В ходе испытаний на воспроизводимость при низких концентрациях при уровне АФП 0,4 нг/мл коэффициенты вариации (CV) для трёх партий составили 17,51 %, 19,73 % и 19,95 % соответственно, причём все значения были ниже 20 %, поэтому предел обнаружения данной системы был установлен на уровне 0,4 нг/мл. При трёх уровнях концентрации — 2, 5 и 20 нг/мл — коэффициент вариации (CV) для разных партий был ниже 10 %, причём в большинстве случаев составлял около 3–5 %, что свидетельствует о хорошей межпартийной точности.
Тестирование специфичности дополнительно показало, что при концентрации CRP 20 нг/мл отклик при определении АФП составлял всего 0,02 нг/мл; при концентрации PCT 20 нг/мл отклик при определении АФП составлял 0,05 нг/мл; в условиях данного эксперимента не наблюдалось выраженной перекрестной реакции.

Обзор характеристик тестирования

VIII. От функциональных материалов до экспресс-диагностики: формирование полной технологической цепочки
В рамках данного исследования была реализована полная цепочка процессов: от получения носителя на основе карбоксильного полистирола, инкорпорирования комплексов редкоземельных элементов, характеристики микросфер с временным разрешением флуоресценции и соединения белков с поверхностью до иммунохроматографического анализа и количественного определения АФП. С точки зрения материалов микросферы обладают однородным размером, длительным временем жизни (порядка миллисекунд), хорошей адаптивностью к pH, стабильностью при хранении и устойчивостью к световому отбеливанию; с точки зрения биологической функционализации эффективность конъюгации белков в оптимизированных условиях достигает 58,51%; с точки зрения применения тестирование на AFP может быть завершено за 15 минут с пределом обнаружения 0,4 нг/мл и хорошей межпартийной точностью.
Данная технологическая схема «люминесцентный материал — функциональные микросферы — иммунологические зонды — тест-полоски POCT» обладает высокой расширяемостью. В дальнейшем, путем замены различных распознающих антител, данную материальную платформу можно будет расширить на другие онкомаркеры, маркеры воспаления и показатели, связанные с инфекционными заболеваниями, а также исследовать возможности комбинированного определения нескольких показателей, усиления сигнала за счет структуры «ядро-оболочка» и технологий промышленного производства, что обеспечит материальную и методологическую основу для разработки высокочувствительных продуктов для экспресс-диагностики.

—— Конец ——