Одна микросфера — два типа лигандов Достигнуты новые успехи в разработке агарозы как сепарационной среды 

Разработка материала CM/PAMPS-AG для выделения и очистки лактоферрина
Какие изменения произойдут, если поместить две категории функциональных групп в одну агарозовую микросферу? В рамках исследований, посвященных выделению и очистке лактоферрина, был получен двулигандный ионообменный материал CM/PAMPS-AG. Результаты исследования показывают, что общая кислотная ионообменная емкость достигает 0,419 ммоль/мл во влажном состоянии, что примерно на 21,4 % превышает показатель однолигандного PAMPS-AG (0,345 ммоль/мл во влажном состоянии).
Это изменение обусловлено перегруппировкой внутренних обменных сайтов материала: на основе сульфокислотных групп, предоставленных поли-AMPS, была введена небольшая доля карбоксиметильных групп. Полученный носитель сохранил 96,4 % емкости сульфокислотных групп по сравнению с монолигандным контролем, одновременно увеличив количество слабокислотных обменных сайтов, что создало новую материальную основу для регулирования характера связывания белка с носителем.

Обеспечение наличия двух типов сайтов обмена на микросферах
В процессе разделения белков хроматографический носитель должен обеспечивать наличие сайтов, способных вступать во взаимодействие с целевым белком. Сшитые агарозовые микросферы можно рассматривать как «каркас», несущий эти сайты, а сульфоксильные и карбоксиметильные группы — как два типа «точек контакта», распределенных по каркасу. При подходящих условиях положительно заряженный белок может вступать в электростатическое взаимодействие с отрицательно заряженными сайтами на носителе.
В конструкции CM/PAMPS-AG сульфокислотные группы выступают в качестве основных лигандов, а карбоксиметильные — в качестве вспомогательных. Сульфокислотные группы обеспечивают сильнокислые обменные сайты; карбоксиметильные группы относятся к слабокислым группам, степень ионизации которых зависит от значения pH. Сочетание этих двух типов групп предоставляет возможности для регулирования поведения связывания и элюирования в различных условиях.

Откуда происходит увеличение емкости
Общая кислотная ионообменная емкость может быть определена как общее количество обменных кислотных сайтов в единице объёма влажной среды. В статье в качестве единого единицы измерения использовался объём осаждённой влажной среды, на основе чего было проведено сравнение одно- и двусоставочных сред. Изменение значения от 0,345 до 0,419 свидетельствует о том, что двусоставочные материалы обладают большим количеством обменных сайтов по данному показателю.

Рис. 2. Общая кислотная ионообменная емкость двух типов среды (столбцы построены с нулевой отметки в одинаковом масштабе)
Преобладание сульфогрупп Дополнение карбоксиметильными группами
Дальнейший анализ показал, что емкость сульфокислотных групп в двухлигандном носителе составляет 0,323 ммоль/мл влажного носителя, емкость карбоксиметильных групп, оцененная методом разности, составляет 0,086 ммоль/мл влажного носителя, а емкость матричного бланка составляет 0,010 ммоль/мл влажного носителя. Эти три составляющие в совокупности образуют общую кислотную ионообменную емкость, равную 0,419 ммоль/мл влажного носителя.

Рис. 3. Состав емкости двухлигандного носителя: доли составляют 77,1 %, 20,5 % и 2,4 % соответственно.
По сравнению с контролем с однолигандным носителем емкость сульфокислотных групп в двухлигандном носителе снизилась с 0,335 до 0,323 ммоль/мл влажного носителя, что составляет снижение примерно на 3,6 %; общая кислотная ионообменная емкость, напротив, увеличилась примерно на 21,4 %. Эти результаты показывают, что увеличение емкости в основном обусловлено введением карбоксиметильных сайтов; конструкция с двумя лигандами изменила соотношение сильных и слабых кислотных сайтов, сохранив при этом основные сульфокислотные сайты.
С точки зрения разработки продукта эти данные дают четкое представление о том, «какие сайты присутствуют в материале и в каком количестве». Фактическая способность связывания белка также зависит от таких факторов, как свойства белка, перенос вещества в порах, скорость потока и условия раствора, поэтому требуется дополнительная оценка с помощью экспериментов по адсорбции белка и хроматографии.
Увеличение количества обменных сайтов с учетом структуры микросфер
Функциональная модификация не только изменяет количество обменных сайтов, но и может влиять на размер микросфер и степень их набухания. Поэтому в статье, помимо сравнения емкости, были также определены средний диаметр частиц, относительный коэффициент набухания и коэффициент массового извлечения для двух типов носителей, чтобы оценить влияние низкой степени карбоксиметилирования на сам материал.

Рис. 4. Сравнение параметров микросфер (средний диаметр и относительный коэффициент набухания)
Средний диаметр и степень набухания изменяются незначительно
Средний диаметр PAMPS-AG и CM/PAMPS-AG составляет 74,2 мкм и 74,8 мкм соответственно; приведенный в статье прирост составляет около 0,8%; относительный коэффициент набухания составляет 1,10 и 1,12 соответственно, а прирост — около 1,8 %. Незначительные изменения обоих параметров свидетельствуют о том, что при использованных в данном исследовании условиях низкой степени карбоксиметилирования введение новых сайтов не сопровождалось значительными изменениями размера микросфер и степени набухания.
Сводная таблица параметров материалов

Указанный в таблице коэффициент массового выхода относится к коэффициенту массового выхода материала среды; содержание твердого вещества во влажной среде обозначает массу сухого твердого вещества, соответствующую одному миллилитру осажденной влажной среды.
Коэффициент массового извлечения для двух типов носителей составил 95,9 % и 93,8 % соответственно, при этом для образца с двойным лигандом он снизился на 2,1 процентных пункта. Сопоставление этого результата с данными о размере частиц и параметрах набухания позволяет более полно понять изменения, вызванные модификацией: в материале появились слабокислые сайты, при этом в основном сохранились характерные особенности структуры микросфер, наблюдавшиеся в оригинальной работе.
Новый выбор материалов для выделения лактоферрина
Направлением применения конструкции с двумя лигандами является предоставление катионообменных материалов для выделения и очистки лактоферрина, которые подлежат дальнейшей оценке. В подходящих условиях раствора лактоферрин несет положительный заряд и может вступать в электростатическое взаимодействие с отрицательно заряженными участками на носителе; изменение условий раствора позволяет регулировать это взаимодействие, создавая операционную основу для захвата и элюции.

Регулирование связывания и элюирования с помощью условий раствора
При хроматографической оценке исходный раствор сначала подвергается центрифугированию, фильтрации и промывке буферным раствором, что позволяет уменьшить влияние нерастворимых компонентов, а также скорректировать pH и электропроводность. Затем образец наносится на хроматографическую колонку, чтобы целевой белок связывался с носителем в подходящих условиях; этап промывки служит для удаления несвязанных или слабосвязанных компонентов.
Повышение концентрации соли в элюенте ослабляет электростатическое взаимодействие между белком и носителем, что приводит к постепенной десорбции связанного белка. В случае CM/PAMPS-AG сочетание сульфокислотных и карбоксиметильных групп создает материальную основу для изучения силы связывания при различных значениях pH и солевых условий. Возможность получения более подходящих условий элюции необходимо оценивать на основе результатов экспериментов с конкретными образцами.
От состава материала к оценке применимости
Полученные результаты четко демонстрируют особенности данного носителя: на основе сшитого агарозы создана структура с сопутствующими сульфокислотными и карбоксиметильными группами; общая кислотная ионообменная емкость увеличилась примерно на 21,4%, сохранив 96,4% емкости сульфокислотных групп по сравнению с однокомпонентным контролем; средний диаметр частиц и относительный коэффициент набухания остались практически неизменными. Эти результаты служат количественной отправной точкой для последующих исследований по разделению белков.
В рамках последующей оценки лактоферрина можно уделить дополнительное внимание количеству адсорбированного белка, динамической связывающей способности, характеристикам элюции, а также показателям многократного использования, а также оценить эффективность процесса с учетом чистоты и коэффициента извлечения. Материал CM/PAMPS-AG, благодаря функциональным сайтам на микросферах, расширяет выбор материалов для изучения условий разделения лактоферрина.